Rita Levi-Montalcini und ihre Zwillingsschwester Paola waren die jüngsten Kinder von vieren einer sephardischen Familie. Ihr Vater Adamo Levi war Ingenieur und Mathematiker, ihre Mutter Adele Montalcini Malerin. Wie Paola, die später Künstlerin wurde, war Rita zunächst musisch interessiert, doch als ihr Kindermädchen an Magenkrebs erkrankte und starb, beschloss sie, Medizin zu studieren.
Anfänglich gegen den Willen ihres Vaters, doch später mit der Unterstützung der Familie schloss sie ihr Studium in Turin 1936 ab und verblieb an der Universität, um als wissenschaftliche Mitarbeiterin den Histologen Giuseppe Levi zu unterstützen. 1938 führte Benito Mussolini, gestützt auf das ‚Manifest der rassistischen Wissenschaftler‚, die italienischen Rassengesetze ein, die Juden unter anderem eine akademische Karriere unmöglich machten. 1938 bis 1940, bevor die Deutschen einmarschierten, arbeitete sie als Gastwissenschaftlerin an einem neurologischen Institut in Brüssel. Von dort kehrte sie zunächst nach Turin zurück, später floh sie mit ihrer Familie abermals vor den Deutschen nach Florenz.
Da sie nicht offiziell an einer Universität forschen konnte, richtete sie sich kurzerhand Labore in ihren Wohnungen ein. In diesen Behelfslaboren begann sie die Forschungsarbeit, für die sie später berühmt werden sollte. Nach dem Krieg unterstützte sie Gesundheitsorganisationen der Alliierten, um gegen Epidemien und Seuchen in Flüchtlingslagern vorzugehen. 1946 erhielt sie ein Stipendium für ein Forschungssemester an der Washington University in St. Louis. Der ebenfalls vor der Judenverfolgung geflohene deutsche Entwicklungsbiologe Victor Hamburger interessierte sich für ihre Forschungen, über die sie in zwei Wissenschaftsmagazinen veröffentlicht hatte. Nachdem es ihr gelang, ihre Forschungsergebnisse in seinem Labor zu reproduzieren, bot er ihr eine Stelle als außerordentliche Professorin an der Universität, die sie für 30 Jahre lang innehaben sollte. 1962 eröffnete sie ein weiteres Labor in Rom und teilte anschließend ihre Zeit zwischen dem amerikanischen unr europäischen Standort auf.
Sie untersuchte das Wachstum von Nervenzellen an Krebstumoren, indem sie Tumorzellen in Hühnerembryonen einbrachte und beobachtete, wie sich Nerven um den Tumor herum bildeten, aber niemals in die Richtung der Blutzufuhr zum Tumor hin; sie schloss daraus, dass der Krebs selbst die Signale für das Nervenwachstum aussandte. Es gelang ihr schließlich, gemeinsam mit dem Biochemiker Stanley Cohen, das Protein zu isolieren, das NGF – nerve growth factor, Nervenwachstumsfaktor – genannt wird. Für diese Arbeit erhielten Levi-Montalcini und Cohen 1986 den Nobelpreis für Medizin und Physiologie.
In den 1990ern stand sie im Mittelpunkt einer Kontroverse um die beschleunigte Freigabe eines Medikaments, zugunsten eines Pharmazeutikherstellers, nachdem überdurchschnittlich viele Patienten nach der Verwendung am Guillain-Barré-Syndrom erkrankten.
In den Jahren zwischen 1966 bis 2011 erhielt sie zahlreiche Auszeichnungen, Medaillen und Ehrendoktortitel. Ein Asteroid wurde nach ihr benannt, 2001 wurde sie als zweite Frau zur Senatorin auf Lebenszeit im italienischen Senat ernannt. Ab 2005 war sie die älteste noch lebende Nobelpreisträgerin, ab 2008 die älteste aller Nobelpreisträger•innen überhaupt und sie wurde die erste Person, die einen Nobelpreis erhielt und über 100 Jahre alt wurde.
2012 starb sie im Alter von 103 – ein Leben, der Forschung gewidmet und gänzlich ohne Sehnsucht nach Ehe oder Kindern.